Erfolgreiche Proteinreinigung: Säulenchromatographie & Gradientenelution

mit LAMBDA Schlauchpumpen und OMNICOLL Fraktionssammler


Für die Proteinreinigung und die Isolierung von Peptiden, Nukleinsäuren oder kleinen Molekülen aus der Fermentationsbrühe wird die Säulenchromatographie (SC) mit Ionenaustausch, hydrophober Wechselwirkung, Affinität oder Größenausschluss im Downstream Processing (DSP) verwendet.

Säulenchromatographie zur Proteinreinigung

Zur Optimierung dieser flüssigkeitschromatographischen Verfahren werden in der Laborpraxis der Fraktionssammler OMNICOLL und die LAMBDA Schlauchpumpen  erfolgreich eingesetzt:

Vorgehen

Für die saubere Trennung des Stoffgemisches ist wichtig, dass die Säule frei von Luftblasen und Rissen mit der stationären Phase gepackt worden ist.

Die LAMBDA Schlauchpumpe trägt die flüssige mobile Phase reproduzierbar und durchgehend möglichst pulsationsfrei auf die gepackte Chromatographiesäule auf.

Das oben auf der Chromatographiesäule aufgebrachte Stoffgemische wird beim Durchlaufen des gepackten Trägermaterials (stationäre Phase) aufgetrennt:

Die Bestandteile aus der Fermentationsbrühe werden unterschiedlich stark von der stationären Phase adsorbiert und wieder desorbiert, wodurch sich die Komponenten im Strom der mobilen Phase (Puffer) langsam voneinander entfernen.

Die nun zonenweise voneinander getrennten Komponenten des Stoffgemisches werden am unteren Ende der Chromatographiesäule mit Hilfe des OMNICOLL Fraktionssammlers in Fraktionen aufgefangen.

Ein Detektor vor dem Fraktionssammler bzw. die Analyse der Fraktionen gibt Aufschluss, in welcher Fraktion sich das gewünschte Protein in hoher Konzentration zur Weiterverarbeitung befindet.


Optimierung des Elutionsverfahren für die Proteinreinigung

Der optimale Eluent für die Säulenchromatographie heisst in der Enzymreinigung, den richtigen Puffer für die Flüssigchromatographie auszuwählen.

Zudem verkürzen Sie die Laufzeit des flüssigkeitschromatographischen Verfahrens indem Sie das richtige Elutionsverfahren wählen:

Isokratische Elution in der Säulenchromatographie

In der Säulenchromatographie werden die Proteine mit einer konstanten Lösungsmittelzusammensetzung (isokratische Elution) getrennt,

  • wenn die Probe nicht sehr komplex ist und die Komponenten im Gemisch unterschiedliche Retentionszeiten aufweisen.

Wird die Probe mit einem Eluenten konstanter Zusammensetzung von der Chromatographiesäule gespült (isokratische Elution), brauchen die am stärksten adsorbierten Proteine sehr viel mehr Zeit, um eluiert zu werden.

Für die isokratische Elution wird ein Puffer und eine Schlauchpumpe eingesetzt.

Gradientenelution – vorteilhaft für die Proteinreinigung aus komplexen Proben

Mit der Gradientenelution ändert sich die Zusammensetzung der mobilen Phase (Fliessmittles) während des Trennvorgangs.

Die Gradientenelution wird vorteilhaft in der Proteinreinigung eingesetzt:

  • Auftrennung von komplexen biologischen Proben
  • Trennung von Gemischen mit bekannten Eigenschaften
  • Trennung von Komponenten mit ähnlichen Retentionszeiten

Wird die Gradientenelution in der Flüssigkeitsäulenchromatographie für die Reinigung von Proteinen eingesetzt, lässt sich die Retentionszeit verkürzen.

Der Aufbau einer Gradientenelution erfolgt mit zwei Puffern und mit einer oder zwei Schlauchpumpen.

Gradientenelution & Gradientenverlauf

Verschiedene Zusammensetzungen des Eluenten (Gradientenelution) ermöglichen die Verteilungskoeffizienten und somit auch die Kapazitätskoeffizienten gezielt zu beeinflussen. Der Gradientenverlauf kann dabei unterschiedliche Profile aufweisen:

Gradientenelutionen Beispiele: Linearer Gradient und Stufengradienten

Meist wird ein linearer Gradientenverlauf angewendet. Daneben kommt der zusammengesetzt lineare Gradientenverlauf (Stufengradienten) und auch konkave oder konvexe Gradientenverläufe zum Einsatz.

Die Laufzeiten werden durch möglichst hohe Flüsse zusätzlich verkürzt.

Schlauchpumpen für die Chromatographie

Die von Biochemikern empfohlenen LAMBDA Schlauchpumpen garantieren ein möglichst pulsationsfreies Auftragen der mobilen Phase.


Aufbau einer Gradientenelution mit automatischer Fraktionssammlung

Gradientenelution mit einer Pumpe

Der Aufbau einer Gradientenelution in der Flüssigsäulenchromatographie mit automatischer Fraktionssammlung des Eluats kann mit einer oder zwei LAMBDA Pumpen erfolgen:

Gradientenelution mit einer Pumpe

Die Gradientenelution ist mit nur einer LAMBDA Pumpe durchführbar:

Der Behälter mit Elutionspuffer A und der Behälter mit Elutionspuffer B sind an deren Böden durch einen Siphon oder mit einem Rohr miteinander verbunden. Das Ventil in der Verbindung zwischen den gleichartigen Behältern dient der Einstellung der Strömung.

  1. Der Elutionspuffer A wird ständig in den gut gerührten Becher mit Elutionspuffer B gezogen, wodurch die Pufferkonzentration verändert wird.
  2. Die programmierbare LAMBDA Schlauchpumpe fördert die Gradientenmischung in die Chromatographiesäule.
  3. Das Eluat fliesst aus der Chromatographiesäule und wird durch den Detektor zur Messung des pH-Werts, Absorption 280 nm und Leitfähigkeit geleitet.
  4. Das Eluat fliesst vom Detektor zum Fraktionssammler LAMBDA OMNICOLL: die Fraktionen des Eluats werden in den gewünschten Behälter (Flaschen, Becher- oder Reagenzgläser, …) gesammelt.

Gradientenelution mit zwei Pumpen

Zur genau reproduzierbaren Mischung der Eluenten für die Gradientenelution werden bevorzugt zwei LAMBDA Schlauchpumpen eingesetzt.

  1. Der zeitliche Verlauf der Änderung der Zusammensetzung kann direkt an den LAMBDA Pumpen programmiert oder mit Hilfe der Steuerungssoftware PNet vorgelegt, aufgezeichnet und als realtime Diagramm laufend dargestellt werden.
  2. Die Gradientenmischung durchläuft Chromatographiesäule und die Komponenten werden aufgetrennt.
  3. Das Eluat der Chromatographiesäule fliesst für die Messung des pH, Absorption 280 nm und Leitfähigkeit durch den Detektor.
  4. Der vollautomatische Fraktionssammler LAMBDA OMNICOLL fraktioniert das Eluat und sammelt die Fraktionen mittels Zeitprogrammierung oder Tropfenzähler.

Während der Elution der Proteine verändert sich die Zusammensetzung des Puffers (Ionenstärke, pH-Wert, Leitfähigkeit, Salzkonzentration usw.). Indem das Verhältnis von Puffers A und Puffer B geändert wird, entstehen wahlweise lineare, schrittweise oder schrittweise segmentierte Elutionsprofile.


Anforderungen an das Pumpensystem für die Säulenchromatographie

Die wichtigsten Anforderungen an das Pumpsystem für die Säulenchromatographie sind:Schlauchpumpen für die Chromatographie im Labor

  1. Eine konstante und reproduzierbare Fließgeschwindigkeit
    Die Reproduzierbarkeit ist abhängig von der Retentionszeiten der Peaks. Die Retentionszeiten sind wiederum abhängig von der Fliessgeschwindigkeit.
  2. Ein möglichst pulsationsfreier Fluss
    Die stationäre Phase soll vor Druckstössen verschont bleiben. Die Grundlinie des Detektors soll ruhig bleiben.

LAMBDA MULTIFLOW zählen zu den programmierbare Schlauchpumpen mit minimierter Pulsation für reproduzierbare Fliessgeschwindigkeiten.

Anforderungen an den Fraktionssammler für die Proteinreinigung

Bester Fraktionssammler für die effiziente Prozessoptimierung im Labor- und Pilotmasstab.

Die wichtigsten Anforderungen an den Fraktionssammmler für die Säulenchromatographie sind:

  1. Uneingeschränkte Kapazität
    Vor allem während der Prozessoptimierung ist die uneingeschränkte Anzahl gesammelter Fraktionen äusserst wichtig.
  2. Unterschiedlichste Volumen
    Damit Sie den Fraktionssammler für die unterschiedlichen Prozesse im Labor- und Pilotmassstab verwenden können.

Der progarmmierbarer Fraktionssammler LAMBDA OMNICOLL ist optimal für die effiziente Prozessoptimierung im Labor- und Pilotmasstab.